儀器計量檢測：多糖分析檢測

儀器計量檢測：多糖分析檢測

糖基化是許多治療蛋白的重要翻譯后修飾，尤其是單克隆抗體(mAb)，已成為一項大生意。由于聚糖構件、鏈長和排列(包括位置和結構異構體)的無限組合，以及糖在分析中幾乎無法區分的事實，聚糖分析已經成為一個越來越外包的分析專業。糖基化是單克隆抗體的主要“關鍵質量屬性”，因此多聚糖分析是一種重要的方法，可用于過程監控、質量控制和建立生物相似性的指定藥物。多糖及其在蛋白質中的表達類似地用作表達單克隆抗體和其他生物治療劑的細胞系的選擇標準。

　　流動相，液相色譜-質譜

　　液相色譜-質譜(LC-MS)已成為聚糖分析的標準分析平臺，但關鍵結構的基線分辨可能需要幾個小時。即便如此，異構聚糖和糖肽或質量相似或相同的聚糖和糖肽并不總是分開的。2021年6月，MOBILion  Systems推出了MOBIE，這是該公司首款商用高分辨率離子遷移質譜(HRIM-MS)系統，基于太平洋西北實驗室2015年開發的新分離技術。MOBIE背后的驅動力是“結構無損離子操縱”(SLIM)，它需要長路徑的離子遷移率分析，并將其折疊回自身數次，從而減少其占用的空間。例如，對于常規實驗室分析來說不切實際的13米線性流動路徑可以縮小到公文包大小。進入分析路徑的材料由路徑周圍的電場引導，以避免分析物和設備之間的碰撞，因此使用“無損”一詞來描述分子路徑。

　　HRIM質譜在幾個方面不同于液相色譜。首先，它發生在氣相和液相色譜的溶液中。分子是根據液相色譜電荷或分子量分離的，而HRIM質譜利用分析物的大小、電荷、形狀和結構。HRIM-質譜還將分析時間從典型的15分鐘縮短到3小時，然后再縮短到2分鐘左右，從而從根本上消除了通量瓶頸。該技術適用于單克隆抗體、整體和亞單位蛋白質、肽和多糖從研究階段到生產階段。

　　MOBILion  Systems首席執行官Melissa  Sherman博士表示：“高度相似的生物分子(如許多聚糖)的LC分離需要延長運行時間，這在分析工作流程中造成了潛在的瓶頸?！薄凹幢闳绱耍恍┚厶堑男袨槿匀蝗绱讼嗨?，以至于不能避免LC的共同流出。相比之下，運行支持MOBIE的MS系統兩分鐘，可為研究環境中蛋白質、肽、多糖和PTM的分離和分析提供高通量和高分辨率選項。我們相信，這種方法可能會減少在過程監控和制造中使用更復雜的基于質譜的表征分析的障礙?！痹S多分析聚糖的分析師(如果不是全部的話)都試圖解決“異構體”的問題，即分子量相同但糖殘基排列不同的——。“HRIM-質譜確實可以幫助識別分辨率和通量更高的異構體圖譜，”謝爾曼告訴生物公司?！疤腔€需要用LC在兩分鐘左右分離6小時，再用HRIM分離?！?/span>

　　多層次可能性

　　治療性蛋白質(也稱為“糖蛋白質組學”)的聚糖分析發生在大約四個水平：在完整蛋白質上，通過部分消化的蛋白質，在單個糖基化肽上，以及在聚糖首先從蛋白質中釋放出來之后。

　　基因編輯和治療公司Prime  Medicine的高級科學家楊洋博士說，糖鏈分析的水平取決于調查的目的和具體的分析物結構。“例如，當蛋白質中有多個聚糖位點時，你可能需要將蛋白質消化成糖肽來研究每個單獨的位點?！睅讉€“水平”也可能參與分子表征過程，為監管提交做準備，“其中使用多種正交方法在釋放的聚糖、糖肽和完整糖蛋白水平上表征聚糖?！?/span>

　　分析人員轉向釋放的聚糖，對細胞、組織或血漿/血清表達的糖蛋白上的單個N-和O-糖基化位點進行準確和全面的聚糖分析。

　　另一方面，糖肽分析用于研究一種或多種蛋白質上的多糖?！斑@種方法的主要特點是可以將糖基化信息與蛋白質中的糖基化位點聯系起來，”CD生物基因的研究科學家Linda  Brown說?！叭欢?，有必要對整個糖蛋白治療劑進行分析，以量化純化的糖蛋白治療劑的N-/O-糖基化，包括計算糖基化位點上每種聚糖的百分比，并估計每種N/O-聚糖的結構?！?/span>

　　BioGlyco專門通過聚糖分析來改進生物治療藥物，這是一種潛力巨大的策略，但通常使用不足。

　　我們傾向于認為聚糖分析主要與質量功能有關，但糖蛋白組學也在藥物發現和創造現有生物制藥的改進版本中發揮作用。

　　“糖基化是一個非常有前途的目標，在個性化醫療方面有很大的潛力，”布朗繼續說道?！岸嗵窃谏镞^程中發揮重要作用，包括細胞粘附、大分子相互作用和病原體入侵。糖組學是基因組學、代謝組學和蛋白質基因組學的補充，顯示了個性化醫學的前景。例如，某些疾病的糖生物標志物可能對個體具有特異性，因此針對特定蛋白質的糖基化是一種有前途的臨床治療策略?！边@些策略可以應用于現有的“個性化”生物治療藥物和專門用于糖基化的新化合物。全階段活動？

　　由于所涉及的專業知識和時間，生物治療藥物的開發人員傾向于將聚糖分析保留在產品生命周期的書架上，——處于發現和開發以及QC的*早表征階段。隨著對糖基化的進一步了解，這種情況正在改變。

　　“糖蛋白在分子和細胞功能中起著關鍵作用，”創意生物實驗室的首席技術官張箐博士說。“治療性糖蛋白的穩定性、血清半衰期、免疫原性和生物活性受其糖基化特征的調節。因此，在生物制劑的所有開發階段，對糖基化特征的需求都在增加。”

　　越來越多的開發人員在生產和質量檢測過程中進行聚糖分析。Creative  Biolabs專注于高通量篩選抗體、Fc融合蛋白、非Fc融合蛋白和糖工程細胞系的策略。"*重要的是，分析是實時進行的，以監控生產過程."一種策略包括通過UHPLC和熒光檢測進行高通量聚糖篩選，這可以在兩周內篩選多達100個樣品，并使用粗澄清介質。張說，基于熒光標記凝集素的第二次高通量篩選大約需要兩個小時。

　　隨著對糖基化重要性的更好理解，聚糖分析正在成為一項需要時間、儀器和專業知識的專業活動，藥物開發人員越來越缺乏或不愿意獲得這些。因為糖基化修飾的QC只發生在特定的時間(雖然頻率在增加)，所以聘請第三方服務提供商可能比內部維護這個功能更方便、更劃算。

　　全世界有130多個組織專門從事多糖分析。英國研究公司Roots  Analysis的一項研究顯示，未來幾年這一細分市場的年增長率將增長15%，這一細分市場服務于每年1300億美元的糖基化蛋白藥物市場需求。

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